Cell Sorting Facility e Servizio di Cell Sorting

CELL SORTING FACILITY dello HuGeF

La Cell Sorting Facility della Human Genetics Foundation (HuGeF) è operativa dall'inizio del 2014 presso la sede dello HuGeF in via Nizza 52 e offre un servizio prioritariamente indirizzato al personale universitario e al personale dello HuGeF, ma è anche a disposizione di ricercatori esterni. La Facility, che si avvale di un Cell Sorter di ultima generazione, acquistato grazie al contributo della Compagnia di San Paolo e inaugurato alla fine del 2013, rappresenta uno strumento importante per creare nuove opportunità per la ricerca biomedica sul territorio. L'impiego di questo strumento versatile dalle grandi potenzialità può accorciare e semplificare notevolmente molti esperimenti, con un notevole risparmio economico e di tempi. Alcune esemplificazioni dell'utilizzo di questo strumento si possono trovare alla fine di questo documento. Per ulteriori esempi e per qualsiasi informazioni sulla Facility è possibile rivolgersi al Dott. Davide Brusa, responsabile del servizio (davide.brusa@hugef-torino.org, tel. 011/670.95.37).

MODALITA' D'USO E TARIFFE

La Cell Sorting Facility funziona su prenotazione tramite e-mail al dott. Brusa ed è a pagamento con una tariffa oraria di 100 euro/ora (IVA esclusa). Per le società la tariffa applicata è di 150 euro/ora (IVA esclusa).
Al momento della prenotazione o comunque prima dell'esperimento, il MODULO DI OFFERTA scaricabile dal sito web dello HuGeF dovrà essere inviato al dott. Brusa debitamente compilato e firmato per accettazione. Al termine dell'esperimento, un "rapporto di servizio" sottoscritto dal rappresentante dello HuGeF e dal cliente, indicherà l'effettiva durata dell'esperimento ed il relativo costo totale.
Tutte le prenotazioni devono rispecchiare l'effettivo uso dello strumento. Eventuali modifiche devono essere notificate entro 24h prima della prestazione. Eventuali ritardi nella presentazione dei campioni da sortare saranno addebitati come tempo ore (e frazioni) dall'ora di prenotazione dello strumento.
Non è possibile effettuare prenotazioni con più di due settimane di anticipo.
Il modello tariffario è stato ideato con l'obiettivo di coprire, almeno parzialmente, i costi di funzionamento (manutenzione e un'unità di personale dedicata) e garantire la sostenibilità della Facility.
Il servizio di sorting viene effettuato da personale specializzato dello HuGeF che fornisce gratuitamente anche supporto per la progettazione dell'esperimento e per la preparazione di domande di finanziamento. Sono sempre incluse nel costo orario le biglie di calibrazione dello strumento, i tubi, i filtri e i liquidi di lavaggio. Anche l'analisi dei dati generati dall'esperimento è inclusa nel servizio ed è effettuata sempre dal personale specializzato dello HuGeF. Nel costo orario del servizio sono esclusi gli anticorpi necessari per marcare le cellule.
Se il servizio di cell sorting è richiesto da strutture che fanno parte del Servizio Sanitario Regionale, le stesse possono richiedere una fatturazione sulla base delle tariffe stabilite nel Tariffario Regionale.
A richiesta, lo HuGeF organizza degli incontri gratuiti con i ricercatori interessati a conoscere le potenzialità del Cell Sorter e a comprendere meglio il suo possibile utilizzo.

CARATTERISTICHE TECNICHE

La Cell Sorting Facility di HuGeF si avvale del Cell Sorter BD (modello FACSAria III) che consente di isolare cellule con le caratteristiche volute all'interno di popolazioni miste. Le cellule possono essere discriminate sulla base di parametri morfologici e/o di espressione di determinati marcatori. La presenza di due laser (488 e 633, vedi sotto le caratteristiche tecniche) consente di usare simultaneamente 8 marcatori diversi. La macchina funziona in sterilità e non danneggia le cellule per cui è possibile ricoltivarle dopo il sorting. Inoltre lo strumento è dotato del modulo a piastra per cui le cellule possono essere separate alla concentrazione desiderata e piastrate direttamente in supporti sterili da 384, 96, 48, 24, 12 o 6 pozzetti. All'interno dei singoli pozzetti possono essere posizionate popolazioni cellulari diverse (per es. linfociti T CD4+ e CD8+) in rapporti predeterminati. Lo strumento può essere usato per "single cell sorting" ai fini di successive amplificazioni e sequenziamenti. Infine se le cellule da separare sono poche è possibile "sortare" direttamente in eppendorf o su vetrino per procedere immediatamente alle analisi successive senza perdere materiale prezioso. Il cell sorter mantiene temperature fisse (per esempio 4°C o 37°C) per esperimenti di tipo funzionale.

Sorgenti luminose

Il Cell Sorter è equipaggiato dei seguenti laser:
- Laser rosso 488 nm
- Laser blu 633 nm

Banco ottico

I composti chimici fluorescenti (fluorocromi) che possono essere analizzati dallo strumento sono i seguenti:
- FITC, Alexa-488, GFP CFSE
- TexasRed, PE-CF594, PI
- PrCP-Cy5.5, PrCP, 7-AAD
- PE-Cy7
- PE, mCHERRY
- APC, Alexa-647
- APC-Cy7, APC-H7
- Alexa-700
È quindi possibile eseguire una colorazione multiparametrica a 8 colori contemporaneamente previa generazione della matrice di compensazione dei fluorocromi utilizzati eseguita qui in sede con l'utilizzo di apposite biglie che verranno fornite nel servizio di sorting.

Nozzle

Il BD FACSAria III può essere impostato su quattro diverse velocità di sorting grazie a differenti nozzles e pressioni: 70µ (70 psi), 85µ (40 psi), 100µ (20 psi), 130µ (10 psi) variabili a seconda delle esigenze sperimentali. Questi nozzles permettono la separazione di quasi tutti i tipi cellulari.

Sorting

Lo strumento può effettuare la separazione cellulare nei seguenti contenitori di raccolta:
- eppendorf da 1,5ml e 2ml (fino a 4 popolazioni)
- microtubi da 1mL e tubi facs 12x75 (fino a 4 popolazioni)
- falcon da 15 ml (fino a 2 popolazioni)
- piastre da 384-, 96-, 48-, 12-, 6-well
- vetrini
È possibile eseguire cell sorting per estrazione di RNA, DNA; single cell sorting per genotipizzazione; analisi citochimiche su vetrino e separazione di cromosomi in metafase.
La camera di iniezione è pressurizzata e prevede sia l'agitazione del campione in aspirazione, sia il mantenimento a temperatura costante (4°, 25°, 37°, 42°).

Analisi e gestione dei dati

Il computer HP Z220 Workstation Microsoft® Windows® SATA è provvisto del BD FACSDiva software v. 7.0 per l'analisi dei dati.

Nel pdf allegato potete trovare alcuni esempi di esperimenti di Sorting.